Родился Александр Федорович в Санкт-Петербурге в семье педагога и инспектора Санкт-Петербургской губернской гимназии Фёдора Ивановича Миддендорфа. В 1837 году получил степень доктора медицины на медицинском факультете Дерптского университета.
Два года работал в Австрии и Германии, где специализировался в области зоологии, этнографии, антропологии. В 1839 году был назначен адъюнктом при кафедре зоологии в университете Святого Владимира.
В 1840 году участвовал в Лапландской экспедиции К. М. Бэра, собирал материалы по орнитологии, малакологии и геологии Лапландии.
В 1842–1845 годах возглавил экспедицию в Северную Сибирь и на Дальний Восток. Открыл плато Путорана, стал первым исследователем полуострова Таймыр, Северо-Сибирской низменности, Амурско-Зейской равнины, Станового хребта, нижней части бассейна Амура, южного побережья Охотского моря, Удско-Тугурского Приохотья, Шантарских островов.
В числе научных достижений Александра Миддендорфа–первое этнографическое описание ряда сибирских народов и первая научная характеристика климата Сибири, определение южной границы распространения многолетней («вечной») мерзлоты, определение зональности растительности, формулировка так называемого «закона Миддендорфа», объясняющего причины извилистости северной границы лесов.
В 1852 году был избран ординарным академиком Петербургской академии наук, а в 1855 году –непременным секретарём академии.
В 1867 году сопровождал в путешествии по России великого князя Алексея Александровича, в 1869 году – великого князя Владимира Александровича. В 1870 году, сопровождая Алексея Александровича в путешествии по Белому морю и на Новую Землю, произвёл важные наблюдения относительно Гольфстрима к востоку от Нордкапа, открыл Нордкапское течение в Баренцевом море.
В 1870 году исследовал Барабинскую степь, в 1878 году – Ферганскую долину.
В 1883 году руководил экспедицией в районы северных губерний: Пермской, Ярославской, Архангельской, Вятской, Вологодской, Костромской и Владимирской.
Умер и похоронен в г. Хеменурм (Эстония)
